课题概述合成代谢是工程细菌的承担之一，但其内部机制其实不了了。本研究成果注解转录因子Cra活性掉调致使甘油过多合成是年夜肠杆菌生长承担的主要缘故原由。甘油的合成会降低1,6-二磷酸果糖程度并激活Cra，从而按捺糖酵解相干酶的活性以及促成糖异生相干酶活性。因为细胞生长依靠葡萄糖的供给，糖异生历程的不妥激活以及糖酵解历程的按捺可能会致使甘油通路引诱作用下侵害细胞生长。德国马克斯·普朗克陆地微生物研究所Hannes Link团队经由过程在甘油通路限速酶表达的启动子中设计了一个Cra联合位点以维持充足高的1,6-二磷酸果糖程度。作者设计了一构成型的引诱型启动子，并在年夜肠杆菌中过多合成为了类胡萝卜素，从而证实了该要领的普适性。相干结果揭晓在《Nature co妹妹unications》。1. 甘油过多合成致使年夜肠杆菌的生长承担为了研究合成代谢路子怎样影响宿主的代谢历程，作者在年夜肠杆菌中过表达甘油生物合成路子。甘油通路是从糖酵解代谢物磷酸二羟丙酮最先的两步反映。第一步反映由3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)催化，将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油。第二步反映在3-磷酸甘油磷酸水解酶(GPP2)催化下，3-磷酸甘油去磷酸化天生甘油。用于合成甘油的年夜肠杆菌菌株从质粒中表达了编码gpd1以及gpp2的两个基因，并缺少甘油激酶基因(glpK)避免甘油作为碳源被哄骗。此中gpd1由pBAD启动子调控，而gpp2由pJ23101启动子调控。在生长承担调控研究中，发明pBAD启动子可以或许线性促成卵白表达。然而，按照通量均衡阐发，pBAD启动子没法调控生长速度以及甘油合成效率。可是，甘油通路引诱作用下，生长速度降落幅度比通量均衡阐发要剧烈患上多，如图1所示。图1 甘油过多合成致使年夜肠杆菌的生长承担2. 甘油合成经由过程降低1,6-二磷酸果糖程度来激活转录因子Cra为切磋致使菌株生长承担的份子机制，作者对于0、0.1 以及 0.5%阿拉伯糖引诱下的代谢组变化举行阐发。共检测到96种代谢物，这些代谢物在0.1%阿拉伯糖引诱下连结相对于恒定，但在0.5%阿拉伯糖引诱时显示出强烈变化。此中，0.5%阿拉伯糖引诱时，甘油通路的直接前体磷酸二羟丙酮降落最强烈。此外，磷酸二羟丙酮上游代谢物1,6-二磷酸果糖(FBP)也是变化最较着的代谢物之一。FBP可激活转录因子Cra，进而按捺糖酵解酶相干基因表达以及促成糖异生酶相干基因表达。低浓度FBP是否可以激活Cra从而调控基因表达以及酶活性。Cra敲除了菌株作为比照组，对于各试验组38个卵白举行阐发，发明0.5%阿拉伯糖组磷酸烯醇丙酮酸合成酶呈现显著上调，而甘油醛-3-磷酸脱氢酶显著降低。由此申明，0.5%阿拉伯糖引诱甘油通路可降低FBP浓度从而激活Cra，致使GapA活性降低、PpsA活性增长。因为菌株在含有低葡萄糖浓度造就基里生长，由此假定糖异生激活是生长承担的主要缘故原由，并举行了证明。此外，在甘油通路高引诱下，Cra敲除了菌株比根蒂根基菌株生长患上更好。是以，Cra可以调控甘油过多合成造成年夜肠杆菌的生长承担。图2 甘油通路的引诱激活转录因子Cra3. 代谢模子猜测甘油合成最优计谋为进一步注解Cra转录是调控甘油合成的一个因素，作者开发了一个小型动力学模子。如图3所示，该模子包罗一种代谢物(1,6-二磷酸果糖)以及两种酶(GapA以及GPD1)。按照Michaelis-Menten动力学，1,6-二磷酸果糖影响糖酵解以及甘油通路的反映速度。作者假定模子中有恒定的流入，并将糖酵解上限反映速度固定为4.9 妹妹ol/g/h，象征着1,6-二磷酸果糖以恒定速度合成从而用于甘油合成或者者生物物资合成。构建三个差别的模子举行阐发，阐发成果显示2xcra模子最优，可得到高甘油通量。是以，模子阐发以为将Cra调控差别酶活性可能会使甘油合成率增长。图3 Cra调控下的pBAD启动子促成甘油合成的理论以及试验阐发4. Cra调控的pBAD启动子可改良生长速度以及甘油合成研究中发明Cra可按捺pBAD-Cra启动子，为证实pBAD-Cra启动子功效，检测野生型以及Δcra菌株中pBAD启动子以及pBAD-Cra启动子活性。成果发明，野生型菌株中，pBAD-Cra启动子活性低于pBAD启动子，申明Cra对于启动子有按捺作用。而在Δcra菌株中，pBAD-Cra启动子的活性略高于pBAD启动子。这些成果注解Cra按捺pBAD-Cra启动子，而这类调控作用在没有Cra存在的环境下不阐扬作用。是以，pBAD-Cra的低活性其实不仅仅是由于序列转变，而是因为Cra自动按捺。图4 Cra对于pBAD启动子的调控作用5. 高甘油通量下Cra调控pBAD启动子维持高1,6-二磷酸果糖程度为了深切切磋Cra调控的动态纪律，作者考查了甘油通路引诱下代谢组以及卵白质组的变化环境。如图5所示，pBAD-Cra菌株可以在较高的甘油合成速度下维持较高的1,6-二磷酸果糖程度。这注解1,6-二磷酸果糖以及Cra之间的彼此作用抵消了1,6-二磷酸果糖的降落趋向。其一，假如1,6-二酸果糖程度低于临界值则Cra活性增长；其二，太高的Cra活性会按捺pBAD-Cra启动子活性并按捺GPD1表达；其三，GDP1太低表达将恢复1,6-二磷酸果糖最初的浓度。是以，这类反馈调治机制不仅使1,6-二磷酸果糖维持在较高程度，提高甘油合成速度，并且能制止年夜肠杆菌从糖酵解到糖异生的代谢改变。图5 甘油通路引诱的代谢物以及卵白质含量变化环境6. Cra调控促成类胡萝卜素过表达型年夜肠杆菌的生长因为许多生物物资合成以糖降解代谢物为前体，为考查该调控机制的普适性，作者哄骗pBAD启动子来调控类胡萝卜素合成与代谢路子。类胡萝卜素生物合成从糖酵解代谢产品丙酮酸以及3-磷酸甘油醛最先，经由过程年夜肠杆菌的甲基赤藓醇磷酸化路子转化为法尼基焦磷酸，法尼基焦磷酸进一步转化为类胡萝卜素。甲基赤藓醇磷酸路子两种酶(Dxs以及Dxr)是从质粒中过分表达的两种pBAD启动子，别离称为pController以及pController-Cra。类胡萝卜素路子的其它酶(CrtE/B/I/Y/Z)由另外一个质粒(p胡萝卜素)哄骗拟南芥原生启动子举行表达。成果显示Cra调治的启动子在合成类胡萝卜素路子高引诱程度下可以维持更高的生长速率，而且高引诱剂不影响细胞生长以及天生速度。这注解，Cra调控的pBAD启动子具备广泛的普适性，经由过程糖酵解代谢物调控其他合成路子成为可能。图6 Cra调控的pBAD启动子可促成类胡萝卜素的年夜量合成总结本研究中，作者使用阿拉伯糖引诱的pBAD启动子来调控年夜肠杆菌的合成代谢路子。虽然在GFP表达的环境下，pBAD启动子显示出引诱剂浓度以及表达率之间具备线性瓜葛，但没有不雅察到甘油过多孕育发生。在该环境下，引诱剂少许增长就可造成伟大的生长承担且合成效率降低，终极致使包孕甘油在内的各生物活性身分浓度降低。研究者经由过程代谢组学以及卵白质组学来切磋了Cra对于pBAD启动子调控及宿主代谢程度的影响。从生物技能远景来看，该要领将有助于改善菌株合成技能，使其可以或许有用应答工业范围生物反映器等外部滋扰以及基因表达等内部滋扰。参考文献Chun-Ying Wang, et al. Metabolome and proteome analyses reveal transcriptional misregulation in glycolysis of engineered E. coli. Nature Co妹妹unications . 2021. https://doi.org/10.1038/s41467-021-25142-0.原文浏览，请扫描下方二维码 特约作者张定坤，四川年夜学华西病院助理研究员兼博士后，研究标的目的为代谢组学。绘谱帮你测本研究哄骗代谢组学联合卵白组学检测与阐发技能展现了转录因子活性掉调对于于年夜肠杆菌糖酵解历程的影响。麦特绘谱拥有业内强盛的Q600全定量代谢组、Q300全定量代谢组、Q200宏代谢组等要领，可提供代谢组学一站式总体解决方案，独家的检测技能、周全的数据陈诉和专业的售后切磋，助力您的科研摸索之路不停立异以及冲破。详情接待咨询麦特绘谱热线400-867-2686，获取具体资料！往期回首